CIC 유전자에 대한 고찰 by Huda Y Zoghbi.

 CIC 유전자에 대한 고찰 by Huda Y Zoghbi.

Disruption of the ATXN1–CIC complex causes a spectrum of neurobehavioral phenotypes in mice and humans.

Nature genetics 역시 feed 를 받아보고 있는데, MECP2 유전자로 유명한 Zoghbi 가 보여서 논문을 읽기 시작하였다. Zoghbi 는 Baylor에 계신 분으로, 1999년 Rett syndrome 이 MECP2 유전자의 돌연변이에 의해 생긴다는 것을 처음으로 밝힌 분이라 익히 알고 있었고, 작년 말 Spinocerebellar ataxia 와 Rett syndrome 관련 연구 업적을 인정받아 Breakthrough Prize 를 수상하기도 하였다.

Huda Yahya Zoghbi, M.D.

읽기 시작한 논문은 CIC 유전자에 관련한 논문으로, 지금까지 Zoghbi 님이 보여주시던 전형적인 mouse KO-행동 실험-target 유전자 찾기 등의 패턴과 크게 다르지 않지만, 실제 CIC 유전자에 돌연변이가 있는 환자를 찾았다는 점이 의미가 있었던 것 같다. 오랜만에 자세하게 정주행 달린 논문.

소개 및 요약
  1. Ataxia 1 (ATXN1) 이라는 유전자는 1993년 처음 발견되었는데, ATXN1 단백질에서 poly-glutamine 길이가 증가하면 spinocerebellar ataxia type-1 라는 질병을 일으킨다고 알려져 있었다.
  2. 이후 같은 그룹에서 ATXN1 유전자에 mutation이 생기면 다양한 신경관련 유전자의 발현이 바뀌게 된다는 것을 발견하였고, ATXN1 이 CIC 이라는 Transcriptional repressor (발현 억제) 단백질과 서로 binding하여 ATXN1-CIC 라는 co-repressor complex 를 만들고, CIC 의 타겟유전자들의 발현을 억제한다 라는 것을 발견하였다.
  3. 이러한 연구들은 ATXN1-CIC complex 의 분자적 기능을 알려주는데 기여하였지만, ATXN-CIC 에 문제가 생기면 developing brain 에서 어떠한 결과를 만들어 내는지 알 수 없었다.
  4. 실제로 Atxn1/Atxn1l 혹은 CIC 유전자가 Knockout (KO) 된 mouse는 얼마 지나지 않아 죽게 된다고 한다. Atxn1-/-; Atxn1l-/- (Atxn1 혹은 Atxn1l 유전자가 없는 mouse) 들은 뇌수종 (hydrocephalus), 복벽결손 (abdominal wall defect), 폐결손 (lung defect) 등의 phenotype을 보였고, CIC KO mouse 역시 동일한 phenotype을 보여줌으로 Atxn1-CIC 가 in vivo 레벨에서도 complex 로 행동한다는 것을 증명해주었다.
  5. Human 에서는 ATXN1 을 포함한 염색체 6번 region이 deletion 이 된 Autism spectrum disorder (ASD), Developmental delay/Intellectual disability (DD/ID), seizure, ADHD 환자가 보고 되었다. 하지만 그 region 에는 다른 유전자들도 포함하고 있어 실제로 ATXN1 과의 연관성을 증명하기는 힘들었다.
  6. CIC 유전자 역시 2개의 missense 돌연변이를 가진 환자가 보고 되었지만, 돌연변이에 대한 Functional study 가 전혀 이루어지지 않은 상태에서 pathogenicity를 말하기는 어려웠다.
  7. 그래서 본 논문은, Atxn1-Atxn1l or CIC, 특히 CIC 가 KO 된 mouse 를 만들어 brain histology, mouse behavior 를 살펴보았고, DD/ID, ASD 와 같은 질병을 가진 환자들에게서 CIC 에 mutation 이 있는 것을 보고하였다.
결과 1. Conditional KO : Emx1-Cre CIC KO
  1. 앞서 이야기한대로, Atxn1/Atxn1l or CIC 유전자가 Knockout 된 mouse는 viable 하지 않기 때문에, conditional knockout 을 진행하였다. 구체적으로, Emx1-Cre를 이용해 developing forebrain 특이적으로, CIC 유전자를 deletion 시켜보았다.
  2. Emx1 은 telencephalon 이라고도 알려진 developing cerebrum에서 embryonic day 10.5 (E 10.5) 부터 발현되기 시작한다. Emx1 promoter 에 Cre 를 이용하면 E 10.5 day 부터 Cre 단백질이 발현되어 forebrain의 excitatory neurons and glia 특이적으로 CIC 를 deletion 시켜준다.
  3. 실제로 forebrain 쪽에서 CIC 단백질이 없어진 것을 Western blot, Immunofluorescent staining 을 이용하여 확인하였고, CIC 의 target 유전자인 Etv1, Etv4, Etv5 역시발현이 줄어든 것을 확인하였다. (CIC의 타겟로 알려짐)
결과 2. Behavior of Emx1-Cre CIC KO mouse
  1. CIC KO Mouse 의 open-filed test를 통해 control mouse에 비해 더 빠른 speed로, 더 많은 distance를 움직였음을 확인하였다.
  2. ADHD 모델에서 low-dose 로 Amphetamine 을 주면 모순적(?)인 calming 한 효과가 있다고 알려진 바가 있었는데, CIC KO mouse 에서도 동일한 효과를 보여주었다.
  3. Maze test를 통해 anxiety 가 줄어들었음을 확인하였고, Fear conditioning assay 를 통해 freezing 도 줄어들었음을 발견하였다. 또한 Spartial test를 통해 learning, mememory 에도 문제가 있음을 발견하였다. 마지막으로, Three-chamber test를 통해 social interaction에는 문제가 없음을 발견하였다.
  4. Conditional KO CIC mouse 에서 Atxn1/Atxn1l 단백질의 양은 줄어들지 않은 것을 보아, 주로 CIC 단백질이 없어짐으로 mouse의 표현형이 driven 된다는 결론을 내릴수 있었다.
결과 3. Brain sections of Emx1-Cre CIC KO mouse
  1. 5 weeks age mouse의 hippocampus와 amygdala는 control 에 비해 문제가 없는 것처럼 보였지만, cortical layer 2-4의 두께가 얇아져 있었다. cortical layer 5-6은 정상. (* cortical layer 2-4? 공부!)
  2. 20 weeks age mouse 역시 cortical layer 5-6 은 정상이었지만, layer 2-4 이 normal 에 비해 두께가 얇아져 있었다. 또한, CA1과 CA3는 정상으로 보이는 반면, Dentate gyrus의 두께가 얇아져 있었다.
  3. Dentate gyrus 는 CA3 region 으로 neuronal signal을 보내기 전에 input 을 받고 프로세싱하는데 중요한 역할을 하는 곳으로 알려져 있다.  Hippocampus의 synaptic plasticity 역시  presynaptic neurotransmitter release 가 많이 줄어들어 있음을 발견하였다.
  4. Neuronal marker 로 layer 별로 staining을 해보았다.
    • CUX1 는 layer 2-4
    • CTIP2 (BCL11B) 는 layer 5-6
    • SATB2 는 layer 2-6.
  5. CTIP2+ neuron 은 control 과 비슷하였지만, CUX1+ neuron이 layer 2-4 에서 많이 줄어들어 있었다. 이것은, CUX1+ neuron 이 layer 2-4의 layer의 두께 변화를 일으키는 주된 원인으로 생간된다고 판단.
  6. 그렇다면 무슨 이유로 layer 2-4 에서 neuron 의 숫자가 줄어들어 layer 두께의 변화를 유도할까?
    • 가정 1 – progenitor 세포들의 분열 (proliferation)에 문제가 생겼을것이다.
    • 가정 2 – progenitor 세포에 문제가 아니라, postnatal 문제, 즉 신경세포의 maturation or maintenance 에 문제가 있을 것이다.
    • 가정 1 증명: Layer 2-4 는 보통 E14.5 – E16.5 에 형성되는데, 이것을 이용하여 E14.5 와 E16.5의 mouse brain을 가지고 ethynyl-2 ́-deoxyuridine (EdU) 로 labeling 을 해보았다. EdU 와 함께 TBR2, PAX6 progenitor marker를 같이 labeling 해보았다. 그 결과, normal control 에 비해 전혀 영향을 받지 않았다.
    • 가정 2 증명-1: Layer 2-4 에서 CUX1+, SATB2+ neuron 들의 숫자는 태어난 직후 (P 0; Postnatal day 0) normal 과 CIC KO mouse가 비슷하다. 하지만, 10일이 지난후 보면 상당히 그 숫자가 줄어들어 있음을 확인할 수 있었다.
    • 가정 2 증명-2: Neurod6-Cre 를 KO도 test 해보았는데, Neurod6 는 postmitotoic excitatory neuron 에서 특이적으로 발현된다고 알려져 있다. Neurod6-Cre를 이용한 CIC KO mouse 역시 동일하게 postnatal maturation 에 문제가 있었다.또한 Apoptotic signal 이 P 5 에서 많이 올라가 있음을 보아 태어난 후 몇일 동안 apoptotic signal 이 올라감으로 neuron 들이 죽어나가는 것을 확인하였다.
결과 4. Opt-Cre CIC KO mouse and RNA-seq
  1. 추가로 Opt (orthopedia homeobox) promoter 이용하여 hypothalamic, medial amygdala neuron 에서 특이적으로 CIC를 KO 해보았다. 왜? 아직 이해를 못했..
  2. 행동실험에서는 특이적으로 social interaction 이 유의적으로 줄어들어 있었지만, Emxl1-Cre CIC KO와는 다르게 brain histological 하게 layer 두께가 줄어들거나 neuronal population 이 줄어 들어있지 않았다. 이상하군.
  3. Opt-Cre CIC KO 에서 좀더 분자적인 변화를 살펴보기 위해, RNA-seq 을 진행하였다.
  4. 여기서 가장 큰 문제는 CIC 가 Opt-Cre 에 없어진 hypothalamic, medial amygdala neuron 들만 sampling 해야한다. 그래서 TRAP 이라는 것을 이용하였는데, 이것은 Translating ribosome affinity purification 라는 것으로, 리보솜에 GFP 를 tagging 하는 기술이다.
  5. 그래서 TRAP을 Cre dependent 한 mouse line에 적용시키면, Cre 가 발현되는 Cell 만 특이적으로 GFP를 tagging 할 수 있고, 이러한 GFP 발현 되는 neuron 세포만 FACS 를 이용하여 쏙쏙 sorting 할 수 있다.
  6. RNA-seq 결과, Opt-Cre CIC KO mouse 의 neuron 들에서 123개 유전자가 control에 비해 발현이 올라갔고, 84개 유전자는 발현이 줄어들었다. 이 유전자들은 nervous system morphology, synaptic transmission 등에 관련된 유전자들이 었다. 그래서..?
결과 5. CIC mutations on patients with DD/ID, ADHD, ASD and seizures.
  1. ExAC DB 를 열어보면, CIC 유전자에 g.42796882G GC loss-of-function variant (frameshift) 가 높은 allele frequency (0.0002826; 34/120298) 를 보여준다.
  2. 즉, 건강한 60,149 사람들 중에서 European 30명, African 3명, Latino 1명이 CIC 유전자에 frame shift 돌연변이를 가지고 있다는 의미. 이 건강한 사람들은 어떻게 설명할 것인가? 논문에서는 sequencing, reporting error 혹은 low grade mosaicism 일 것으로 이야기한다.
  3. 실제로, 이 그룹에서는 총 5명의 CIC 유전자에서 de novo truncating mutation 을 가진 환자들을 찾았다. 5명 환자들 모두 DD/ID, ADHD, ASD, seizure 를 가지고 있었다.
  4. Family-2의 2명 proband는 genotyping 결과 germline mosaicism 으로 segregation 된것으로 발견되었다.
  5. Family-4 는 아빠가 mosaic (약 15%) 였는데, proband 만 het mutant allele를 가지고 있었고, 나머지 2명의 남동생들은 wild type allele 만 가지고 있었다.  개인적으로 Family-4 가 참 흥미롭다. 아빠의 sperm에 15% 정도가 CIC 돌연변이를 가지고 있는데, 우연히 15% 에 해당하는 sperm 을 첫째 아들이. 나머지 75% 정도 중에서 둘째, 셋째 아들이 우연히 받았다는 것. 불공평한 세상. 흑흑

궁금한 점 및 의문.
  1. 실제로 연구의 흐름이 이렇게 되었는지 궁금하다.
    • ASD 나 DD/ID를 가진 환자들의 WES 분석을 통해 CIC 돌연변이를 먼저 찾은 것인지.
    • 아니면, CIC KO mouse 표현형을 보고 환자를 후에 찾은 것인지.
  2. ExAC DB 를 열어보면, 논문에서 이야기한 돌연변이 말고도 추가로 7개 정도 Loss of function 돌연변이가 보고되어 있다 (5개 splicing, 1개 frameshift, 1개 stop gain). 이것은 정말 예외로 생각할 수 있는 것일까?
  3. gnomAD data를 열어보면… 헐!! 이게 왠일. 논문에서 말한 돌연변이를 포함하여 2개의 frameshift 돌연변이가 DB에서 사라졌다. 나머지 6개 돌연변이는 그대로 존재. 어떻게 해석해야 할까……?
  4. RNA-seq data가 주는 의미는? 단순히 DEG 몇개를 던져주었을 뿐, 더 이상의 정보를 제공해주지 않는다. 이러한 DEG  유전자들이 또 다른 candidate 라는 것?
  5. Mouse brain에 관련된 분자적인 실험 (IHC, IF 등) 이나 mouse behavior 실험은 정말 공부할 만한 논문이다.
  6. 하지만 분자적 매커니즘 스터디는 없는 것 같다. 예를 들어, 환자들은 de novo het mutation 이었다. 그렇다면 dominant negative mutation 으로 생각되는데, 나머지 allele 에서 만들어지는 CIC 단백질은 Atxn1 단백질과 complex를 이루어 행동하기에는 부족하다는 것인가? 등등. 궁금한게 많다ㅋㅋㅋ