Div-Seq?

Div-Seq? 이것보단 ‘biSNE’가 더 중요?

Facebook Broad Institute Page에 좋아요를 눌렀더니 Science에 논문 나왔다고 자랑. 누구인가 살펴봤더니 그동안 너무너무너무 자주 뵈었던 두분이 계시길래 바로 정독.  바로 Aviv Regev님과 Feng Zhang님! 논문 주제도 요즘 많이 보이는 Sing cell RNA-seq에 관한 것인데, 좀 더 specific하게 proliferation 되어지는 세포만 target한다는 것이 주된 내용. 그냥 한마디로 새로운 시퀀싱 기술. 하지만 더 관심이 가는건 biSNE라는 clustering  분석 방법…ㅋㅋ

Peoples

이 두분은 연구실에서 저널클럽을 하면서 높은 빈도로 논문에 이름이 보이거나 책임저자든 공동저자든  우리들의 입에서 자주 오르내리던 님들이 아닐까 생각된다. 그만큼 impact 있는 연구도 하시고.. 논문만 나오면 Nature나 Science니 ㄷㄷㄷ 저널클럽을 준비하는 대학원생에겐 자주 보일수 밖에.. 두분 다 Broad Institute에 계시고 Aviv Regev님은 HHMI에 라는 것과 CRISPR 장인 Feng Zhang라는 것만으로도.. ㅎㄷㄷ

https://www.broadinstitute.org/about/core-members/aviv-regev

Aviv Regev from Broad Institute

https://www.broadinstitute.org/history-leadership/scientific-leadership/core-members/feng-zhang

Feng Zhang from Broad Institute

정리.

  1. 한계
    • 현재 많이들 하시는 Singcell RNA-seq (scRNA-seq)은 Enzymatic Tissue dissociation을 해야 하기 때문에 neuron의 integrity 혹은 RNA content에 영향을 줄 수 있음. 그렇다네요..
    • 성인의 뇌에서 새롭게 만들어지는 neuron들은 잡아내기가 어려웠음. 왜? adult neuron은 cell-tagging이 부족하고, dynamic하게 진행되는 neurogenesis와 같은 과정에서 phase별로 새롭게 만들어지는 neuron 세포들만 특이적으로 isolation 하기가 어려웠어. 간단하게 말하면, 분석해야할 재료가 쉽게 망가지고 정말 희귀한 세포들은 잡기가 어렵다는것. 아아아 누가 몰라 다 알지. 못할뿐이지..
  2. 가설
    • Neuron의 integrity 혹은 RNA-content에 영향을 안주려면? sNuc-Seq을 이용하면 되잖아!
      •  sNuc-Seq은 Enzymatic tissue dissociation를 진행하지 않기 때문에 neuron 세포를 망가트리지 않고, Fixation과 원심분리를 이용해 세포의 핵!!!만 분리해 내는 기술. 그렇게 분리된 nuclei들 중에서 FACS를 이용해 딱 하나만 쏙!! 빼내서 RNA-seq 고고.
    • Adult에서 새롭게 만들어진 희귀하신 세포만 어떻게 뽑아내지? EdU labeling 하면 되잖아?
      • EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)는 Click이라는 화학물질을 이용해 새롭게 합성되는 DNA나 지금 막막막 분열하고 있는 세포에  쏙쏙 들어가서 labeling이 된다고 합니다. 결국 요렇게 표지가 된 세포는 Edu를 처리한 시점이후로 새롭게 만들어진 세포라는 것.
    • 그래서, sNuc-Seq + EdU labeling = Div-Seq 이라는 공식아닌 공식 말입니다. 사실 이것만 이해하면 이 논문 그냥 끝난 것 같습니다. 이후로는 “이거 이용하면 지금까지 할 수 없었던 일들을 할 수 있더라..”전형적인 method 논문ㅋㅋ
  3. 증명
    • Adult mouse hippocampus에서 1,367개정도의 세포를 위에 방법대로 일단은 sNuc-Seq 분리해서 분석해보니, 정말 깔끔하게 clustering되고, hippocampus의 subregion에 따라서도 데이터가 잘 나눠지는 것을 보여주었습니다.
    • 여기서 한가지 제가 궁금했던 분석은 biSNE라는 새로운 clustering 분석이었습니다. 논문 결과보다 이걸 지금 당장 해보고 싶은 마음뿐..ㅋㅋ 지금까지 많이 보여지던 PCA, MDS와 같은 clustering 분석을 사용하지 않고, ‘biSNE (biclustering on Stochastic Neighbor Embedding)‘라는 분석을 사용했는데.. 논문에서는 single cell 특이적으로 사용해야한다라는 언급이 없는 것을 보면, 일반적인 RNA-seq 데이터 분석에도 사용해도 될 것 같음. 구글신께 물어봐도 아직은.. 잘 안나옴..
    • 그리고 이제 EdU labeling 까지해서 그럼 이번엔 Div-Seq DG와 SC neuron에 적용을 해보았습니다. 당연히 이곳에는 ‘시간‘ 개념이 들어가겠죠. 신경 줄기세포인 stem-cell에 EdU labeling을 하고 각각 2일, 4일, 6일, 7일, 14일 후에 Div-Seq을 진행해서 어떻게 유전자들이 행동하는가를 살펴봤습니다.
    • 예상대로 새로운 세포가 생겨나는 초기에는 Proliferation, Differentiation 관련된 유전자들이 행동하다가 점점 Axonogenesis, neural development. 나중에는 Synaptic 관련 유전자들이 행동하는 것을  깔끔하게 보여주었습니다. 그리고 DG와 SC neuron에서 나온 데이터를 비교해 같이 행동하는 유전자 혹은 다르게 행동하는 유전자들이 무엇이 있는지 분석해 보았습니다. 사실 여기는 그냥 confirm 하는 정도 분위기라서 그렇게 자세히 나오진 않은듯..
  4. 결론
    • Div-Seq 이용하면 Singcell level로도 RNA-seq 데이터 아주 깔끔해!
    • Neurogenesis와 같은 다이나믹한 과정도 Div-Seq 이용하면 잡아낼 수 있어!
    • biSNE clustering이라는 분석방법을 새로 만들었어. 한번 써봐.

개인적으로 내가 neuron 세포 하나만 분리해서 RNA-seq을 해야할 때가 있을지 모르겠다..

하지만 여기서 사용된 biSNE clustering이라는 분석을 사용하게 될때가 훨씬훨씬훨씬 많을것 같다. 다른 것 모르겠고, 저거 빨리 R package로 나왔으면….ㅋㅋㅋㅋ